Test RT-PCR wykrywający SARS-CoV-2 ujawnia 10 głównych wad naukowych na poziomie molekularnym i metodologicznym: konsekwencje dla wyników fałszywie dodatnichZewnętrzna ocena partnerskaPieter Borger, Bobby Rajesh Malhotra i wsp.Globalne badaniaRaport przeglądowy Cormana-Drostena
Abstrakcyjny
W publikacji zatytułowanej „Detection of 2019 new coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR” (Eurosurveillance 25 (8) 2020) autorzy przedstawiają procedurę diagnostyczną oraz protokół RT-qPCR do wykrywania i diagnostyki 2019-nCoV (obecnie znany jako SARS-CoV-2), który, jak twierdzą, został zweryfikowany, a także stanowi solidną metodologię diagnostyczną do stosowania w laboratoriach zajmujących się zdrowiem publicznym.
W świetle wszystkich konsekwencji wynikających z tej publikacji dla społeczeństw na całym świecie, grupa niezależnych badaczy dokonała przeglądu punktowego powyższej publikacji, w której 1) sprawdzono krzyżowo wszystkie elementy przedstawionego projektu testu, 2) Oceniono z uwzględnieniem zaleceń protokołu qPCR RT-qPCR dobrą praktykę laboratoryjną oraz 3) parametry zbadane na podstawie odpowiedniej literatury naukowej z tej dziedziny.
W opublikowanym protokole RT-qPCR do wykrywania i diagnostyki 2019-nCoV oraz w manuskrypcie występują liczne błędy techniczne i naukowe, w tym niewystarczający projekt startera, problematyczny i niewystarczający protokół RT-qPCR oraz brak dokładnej walidacji testu. Ani prezentowany test, ani sam manuskrypt nie spełniają wymogów dopuszczalnej publikacji naukowej. Ponadto nie wspomniano o poważnych konfliktach interesów autorów. Wreszcie, bardzo krótki czas między złożeniem a przyjęciem publikacji (24 godziny) oznacza, że albo nie przeprowadzono tu systematycznego procesu recenzowania, albo jego jakość jest problematyczna. Dostarczamy przekonujących dowodów na kilka naukowych nieścisłości, błędów i wad.
Biorąc pod uwagę przedstawione tutaj błędy naukowe i metodologiczne, jesteśmy przekonani, że redakcja Eurosurveillance nie ma innego wyjścia, jak wycofać publikację.
Zwięzłe sprawozdanie z przeglądu
Artykuł ten pokaże wiele poważnych błędów w artykule Cormana-Drostena, którego znaczenie doprowadziło do światowych błędnych diagnoz zakażeń przypisywanych SARS-CoV-2 i związanych z chorobą COVID-19. Mamy do czynienia z rygorystycznymi blokadami, które zniszczyły życie i środki do życia wielu ludzi, ograniczony dostęp do edukacji, a te narzucone przez rządy na całym świecie ograniczenia stanowią bezpośredni atak na podstawowe prawa ludzi i ich wolności osobiste, powodując dodatkowe szkody dla całych gospodarek skala globalna.
Istnieje dziesięć fatalnych problemów z artykułem Cormana-Drostena, które szczegółowo opiszemy i wyjaśnimy w następnych rozdziałach.
Pierwszą i główną kwestią jest to, że nowy koronawirus SARS-CoV-2 (w publikacji o nazwie 2019-nCoV iw lutym 2020 r. Nazwany SARS-CoV-2 przez międzynarodowe konsorcjum ekspertów od wirusów) jest oparty na sekwencjach in silico (teoretycznych) , dostarczony przez laboratorium w Chinach [1], ponieważ w tamtym czasie autorzy nie mieli dostępu do materiału kontrolnego zakaźnego („żywego”) lub inaktywowanego SARS-CoV-2 ani izolowanego genomowego RNA wirusa. Jak dotąd autor nie przeprowadził żadnej walidacji opartej na izolowanych wirusach SARS-CoV-2 lub ich pełnej długości RNA. Według Cormana i wsp .:
„Chcieliśmy opracować i wdrożyć solidną metodologię diagnostyczną do użytku w laboratoriach zdrowia publicznego bez dostępnego materiału wirusowego”. [1]
W tym miejscu należy skupić się na dwóch zadeklarowanych celach: a) opracowaniu ib) wdrożeniu testu diagnostycznego do użytku w laboratoriach zdrowia publicznego. Celów tych nie można osiągnąć bez posiadania żadnego faktycznego materiału wirusowego (np. Do określenia zakaźnego obciążenia wirusem). W każdym razie tylko protokół o maksymalnej dokładności może być obowiązkowym i głównym celem w każdym scenariuszu wynikającym z tej wielkości. Określenie krytycznego obciążenia wirusem jest informacją obowiązkową, a Christian Drosten jest odpowiedzialny za przeprowadzenie tych eksperymentów i dostarczenie kluczowych danych.
Niemniej jednak te sekwencje in silico zastosowano do opracowania metodologii testu RT-PCR w celu zidentyfikowania wyżej wymienionego wirusa. Model ten opierał się na założeniu, że nowy wirus jest bardzo podobny do SARS-CoV z 2003 r., Ponieważ oba są beta-koronawirusami.
W związku z tym zaprojektowano test PCR z wykorzystaniem sekwencji genomowej SARS-CoV jako materiału kontrolnego dla składnika Sarbeco; wiemy o tym z naszej osobistej komunikacji e-mailowej z [2] jednym ze współautorów artykułu Cormana-Drostena. Ta metoda modelowania SARS-CoV-2 została opisana w artykule Cormana-Drostena w następujący sposób:
„Ustanowienie i walidacja procedury diagnostycznej dla badań przesiewowych 2019-nCoV i specyficznego potwierdzenia, zaprojektowanych w przypadku braku dostępnych izolatów wirusa lub próbek pochodzących od pacjentów. Projektowanie i walidacja były możliwe dzięki ścisłemu powiązaniu genetycznemu z SARS-CoV 2003 i wspomagane przez zastosowanie technologii syntetycznych kwasów nukleinowych ”.
Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) to ważna technologia biomolekularna do szybkiego wykrywania rzadkich fragmentów RNA, które są znane z góry. W pierwszym etapie cząsteczki RNA obecne w próbce są poddawane odwrotnej transkrypcji w celu uzyskania cDNA. CDNA jest następnie amplifikowane w reakcji łańcuchowej polimerazy przy użyciu określonej pary starterów i termostabilnego enzymu polimerazy DNA. Technologia jest bardzo czuła, a jej granicą wykrywalności jest teoretycznie 1 cząsteczka cDNA. Na specyfikę PCR duży wpływ mają błędy w projektowaniu biomolekularnym.
Co jest ważne podczas projektowania testu RT-PCR i ilościowego testu RT-qPCR opisanego w publikacji Cormana-Drostena?
To read complete article click here
Podsumowanie katalogu błędów znalezionych w artykule
Artykuł Cormana-Drostena zawiera następujące szczegółowe błędy:
1. Nie ma określonego powodu, aby używać tych wyjątkowo wysokich stężeń starterów w tym protokole. Opisane stężenia prowadzą do zwiększonych niespecyficznych wiązań i amplifikacji produktów PCR, co sprawia, że test nie nadaje się jako specyficzne narzędzie diagnostyczne do identyfikacji wirusa SARS-CoV-2.
2. Sześć nieokreślonych chwiejnych pozycji wprowadzi ogromną zmienność w rzeczywistych laboratoryjnych wdrożeniach tego testu; mylący niespecyficzny opis w artykule Cormana-Drostena nie nadaje się jako standardowy protokół operacyjny, co czyni test nieodpowiednim narzędziem diagnostycznym do identyfikacji wirusa SARS-CoV-2.
3. Test nie pozwala na rozróżnienie między całym wirusem a jego fragmentami. W związku z tym test nie może być używany do diagnostyki nienaruszonych (zakaźnych) wirusów, co czyni go nieodpowiednim narzędziem diagnostycznym do identyfikacji wirusa SARS-CoV-2 i wyciągania wniosków na temat obecności infekcji.
4. Różnica 10 ° C w odniesieniu do temperatury renaturacji Tm dla pary starterów 1 (RdRp_SARSr_F i RdRp_SARSr_R) również sprawia, że test nie nadaje się jako specyficzne narzędzie diagnostyczne do identyfikacji wirusa SARS-CoV-2.
5. Poważny błąd to pominięcie wartości Ct, przy której próbkę uznaje się za pozytywną i negatywną. Tej wartości Ct nie znaleziono również w kolejnych zgłoszeniach, co sprawia, że test nie nadaje się jako specyficzne narzędzie diagnostyczne do identyfikacji wirusa SARS-CoV-2.
6. Produkty PCR nie zostały zwalidowane na poziomie molekularnym. Fakt ten sprawia, że protokół jest bezużyteczny jako specyficzne narzędzie diagnostyczne do identyfikacji wirusa SARS-CoV-2.
7. Test PCR nie zawiera ani unikalnej kontroli pozytywnej do oceny jego swoistości wobec SARS-CoV-2, ani kontroli negatywnej wykluczającej obecność innych koronawirusów, co sprawia, że test nie nadaje się jako specyficzne narzędzie diagnostyczne do identyfikacji SARS-CoV-2 wirus.
8. Projekt testu w pracy Cormana-Drostena jest tak niejasny i wadliwy, że można iść w dziesiątki różnych kierunków; nic nie jest znormalizowane i nie ma SOP. To silnie kwestionuje naukową trafność testu i czyni go nieodpowiednim narzędziem diagnostycznym do identyfikacji wirusa SARS-CoV-2.
9. Najprawdopodobniej artykuł Cormana-Drostena nie był recenzowany, przez co test nie nadawał się jako specyficzne narzędzie diagnostyczne do identyfikacji wirusa SARS-CoV-2.
10. Znajdujemy poważne konflikty interesów w przypadku co najmniej czterech autorów, oprócz faktu, że dwóch autorów artykułu Cormana-Drostena (Christian Drosten i Chantal Reusken) jest członkami rady redakcyjnej Eurosurveillance. Konflikt interesów został dodany 29 lipca 2020 r. (Olfert Landt jest dyrektorem generalnym TIB-Molbiol; Marco Kaiser jest starszym badaczem w GenExpress i służy jako doradca naukowy TIB-Molbiol), co nie zostało zadeklarowane w oryginalnej wersji (i nadal jest brak w wersji PubMed); TIB-Molbiol to firma, która jako pierwsza wyprodukowała zestawy do PCR (Light Mix) na podstawie protokołu opublikowanego w rękopisie Cormana-Drostena i według ich własnych słów rozprowadzała te zestawy do testów PCR przed publikacją nawet złożone [20]; ponadto Victor Corman i Christian Drosten nie wspomnieli o swojej drugiej przynależności: komercyjnym laboratorium testowym „Labor Berlin”. Obaj są tam odpowiedzialni za diagnostykę wirusów [21], a firma działa w dziedzinie testów PCR w czasie rzeczywistym.
Test COVID-19 RT-PCR: Jak wprowadzić w błąd całą ludzkość. Używanie „testu” do blokowania społeczeństwa
W świetle naszej ponownej analizy protokołu testowego w celu identyfikacji SARS-CoV-2 opisanego w artykule Cormana-Drostena zidentyfikowaliśmy błędy i nieodłączne błędy, które czynią test SARS-CoV-2 PCR bezużytecznym.
Wniosek
Decyzja co do tego, które protokoły testów zostaną opublikowane i szeroko udostępnione, leży bezpośrednio w rękach Eurosurveillance. Decyzja o rozpoznaniu błędów widocznych w artykule Cormana-Drostena ma tę zaletę, że w przyszłości znacznie zminimalizuje koszty ludzkie i cierpienie.
Czy wycofanie tego dokumentu nie leży w najlepszym interesie Eurosurveillance? Nasz wniosek jest jasny. W obliczu wszystkich ogromnych wad i błędów w projektowaniu protokołu PCR, które opisano tutaj, dochodzimy do wniosku: Niewiele pozostaje wyboru w ramach naukowej rzetelności i odpowiedzialności.
To read complete article click here
Uwaga dla czytelników: kliknij przyciski udostępniania powyżej lub poniżej. Prześlij ten artykuł do swoich list e-mailowych. Crosspost na swoim blogu, forach internetowych. itp.
Autorski
1) Dr Pieter Borger (MSc, PhD), Molecular Genetics, W + W Research Associate, Lörrach, Niemcy
2) Rajesh Kumar Malhotra (Artist Alias: Bobby Rajesh Malhotra), były artysta 3D / naukowe wizualizacje w CeMM - Centrum Medycyny Molekularnej Austriackiej Akademii Nauk (2019-2020), University for Applied Arts - Department for Digital Arts Vienna, Austria
3) Dr Michael Yeadon BS (z wyróżnieniem) Biochem Tox U Surrey, PhD Pharmacology U Surrey. Dyrektor zarządzający, Yeadon Consulting Ltd, były główny naukowiec Pfizer, Wielka Brytania
4) Dr Clare Craig MA, (Cantab) BM, BCh (Oxon), FRCPath, Wielka Brytania
5) Kevin McKernan, BS Emory University, Chief Scientific Officer, założyciel Medical Genomics, zaprojektował sekwencjonowanie w WIBR / MIT dla Human Genome Project, wynalazł i opracował sekwencer SOLiD, otrzymał patenty związane z PCR, izolacją i sekwencjonowaniem DNA, USA
6) Prof. dr Klaus Steger, Katedra Urologii, Urologii Dziecięcej i Andrologii, Andrologii Molekularnej, Centrum Badań Biomedycznych Uniwersytetu Justusa Liebiga, Giessen, Niemcy
7) Dr Paul McSheehy (BSc, PhD), Biochemik & Industry Pharmacologist, Loerrach, Niemcy
8) Dr Lidiya Angelova, magister biologii, doktor mikrobiologii, była badaczka w National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), Maryland, USA
9) Dr Fabio Franchi, były Dirigente Medico (MD) w oddziale chorób zakaźnych, specjalizujący się w „chorobach zakaźnych” oraz „higienie i medycynie prewencyjnej”, Società Scientifica per il Principio di Precauzione (SSPP), Włochy
10) dr med. Thomas Binder, internista i kardiolog (FMH), Szwajcaria
11) Prof. Dr. med. Henrik Ullrich, specjalista radiologii diagnostycznej, główny lekarz w Centrum Radiologii Szpitala Collm Oschatz, Niemcy
12) Prof. dr Makoto Ohashi, emerytowany profesor, doktor mikrobiologii i immunologii, Uniwersytet Tokushima, Japonia
13) dr Stefano Scoglio, B.Sc. Dr, mikrobiolog, dietetyk, Włochy
14) Dr Marjolein Doesburg-van Kleffens (mgr, dr), specjalista medycyny laboratoryjnej (chemia kliniczna), Maasziekenhuis Pantein, Beugen, Holandia
15) dr Dorothea Gilbert (mgr inż.), Doktor nauk humanistycznych w zakresie chemii i toksykologii środowiska. DGI Consulting Services, Oslo, Norwegia
16) dr Rainer J. Klement, PhD. Oddział Radioterapii Onkologicznej Szpitala Leopoldina w Schweinfurt, Niemcy
17) dr Ruth Schruefer, dr, genetyka / immunologia człowieka, Monachium, Niemcy,
18) Dra. Berber W. Pieksma, lekarz ogólny, Holandia
19) dr med. Jan Bonte (GJ), konsultant neurolog, Holandia
20) Dr Bruno H. Dalle Carbonare (biolog molekularny), specjalista ds. Własności intelektualnej, BDC Basel, Szwajcaria
21) Dr Kevin P. Corbett, MSc Nursing (Kings College London) PhD (London South Bank) Social Sciences (Science & Technology Studies) Londyn, Anglia, Wielka Brytania
22) Prof. dr Ulrike Kämmerer, specjalista w dziedzinie wirusologii / immunologii / biologii człowieka / biologii komórkowej, Szpital Uniwersytecki Würzburg, Niemcy
Uwagi
[1] Corman Victor M, Landt Olfert, Kaiser Marco, Molenkamp Richard, Meijer Adam, Chu Daniel KW, Bleicker Tobias, Brünink Sebastian, Schneider Julia, Schmidt Marie Luisa, Mulders Daphne GJC, Haagmans Bart L, van der Veer Bas, van den Brink Sharon, Wijsman Lisa, Goderski Gabriel, Romette Jean-Louis, Ellis Joanna, Zambon Maria, Peiris Malik, Goossens Herman, Reusken Chantal, Koopmans Marion PG, Drosten Christian. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3):pii=2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045
[2] Email communication between Dr. Peter Borger & Dr. Adam Meijer: Supplementary Material
[3] Jafaar et al., Correlation Between 3790 Quantitative Polymerase Chain Reaction–Positives Samples and Positive Cell Cultures, Including 1941 Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Isolates. https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa1491/5912603
[4] BBC, January 21st 2020: https://www.bbc.com/news/world-asia-china-51185836;
Archive: https://archive.is/0qRmZ
[5] Google Analytics – COVID19-deaths worldwide: https://bit.ly/3fndemJ
Archive: https://archive.is/PpqEE
[6] Laboratory testing for COVID-19 Emergency Response Technical Centre, NIVD under
China CDC March 15th, 2020: http://www.chinacdc.cn/en/COVID19/202003/P020200323390321297894.pdf
[7] Real-Time PCR Handbook Life Technologies: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-
handbook.pdf
Nolan T, Huggett J, Sanchez E.Good practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR) First Edition 2013
[8] Trestan Pillonel et al, Letter to the editor: SARS-CoV-2 detection by real-time RT-PCR: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7268274/
[9] Kurkela, Satu, and David WG Brown. “Molecular-diagnostic techniques.” Medicine 38.10
(2009): 535-540.
[10] Wolfel et al., Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x
[11] Thermofischer Primer Dimer Web Tool: https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html
[12] Primer-BLAST, NCBI – National Center for Biotechnology Information: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
[13] Marra MA, Steven JMJ, Caroline RA, Robert AH, Angela BW et al. (2003) Science. The
Genome sequence of the SARS-associated coronavirus. Science 300(5624): 1399-1404.
[14] Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete
genome: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947
[15] Borger P. A SARS-like Coronavirus was expected but nothing was done to be prepared. Am J Biomed Sci Res 2020. https://biomedgrid.com/pdf/AJBSR.MS.ID.001312.pdf
https://www.researchgate.net/publication/341120750_A_SARS-
like_Coronavirus_was_Expected_but_nothing_was_done_to_be_Prepared;
Archive: https://archive.is/i76Hu
[16] Eurosurveillance paper evaluation / review process: https://www.eurosurveillance.org/evaluation
[17] Official recommendation of the Corman-Drosten protocol & manuscript by the WHO,published on January 13th 2020 as version 1.0 of the document:
https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus-assay-
v1991527e5122341d99287a1b17c111902.pdf; archive: https://bit.ly/3m3jXVH
[18] Official WHO-recommendation for the Corman / Drosten RT-qPCR-protocol, which
directly derives from the Eurosurveillance-publication, document-version 2-1, published on
17th January 2020: https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-
1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2
[19] Eurosurveillance Editorial Board, 2020: https://www.eurosurveillance.org/upload/site-
assets/imgs/2020-09-Editorial%20Board%20PDF.pdf;
Archive: https://bit.ly/2TqXBjX
[20] Instructions For Use LightMix SarbecoV E-gene plus EAV Control, TIB-Molbiol & Roche
Molecular Solutions, January 11th 2020: https://www.roche-as.es/lm_pdf/MDx_40-0776_96_Sarbeco-E-
gene_V200204_09164154001 (1).pdf
Archive, timestamp – January 11th 2020: https://archive.is/Vulo5;
Archive: https://bit.ly/3fm9bXH
[21] Christian Drosten & Victor Corman, responsible for viral diagnostics at Labor Berlin:
https://www.laborberlin.com/fachbereiche/virologie/
Archive: https://archive.is/CDEUG
[22] Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan Viral cultures for COVID-
19 infectivity assessment. Systematic review. Systematic review doi:
https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.08.04.20167932v4
[23] Kim et al.,The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420304062
[24] ECDC reply to Dr. Peter Borger, 18th November 2020:
Supplementary Material
[25] Prof. Dr. Ulrike Kämmerer & team, survey & Primer-BLAST table:
Supplementary Material
Brak komentarzy:
Prześlij komentarz