Biochem Biophys Res Commun . 26 listopada 2020; 533 (1): 195–200.
Opublikowane online 2020 września 11. doi: 10.1016 / j.bbrc.2020.09.018
PMCID: PMC7486059
PMID: 32958250
Silne działanie przeciwwirusowe nanocząstek srebra na SARS-CoV-2
Powiązane dane
Abstrakcyjny
Pandemia COVID-19 rozprzestrzenia się bez kontroli z powodu braku skutecznych środków przeciwwirusowych. Badano, że nanocząsteczki srebra (AgNP) mają właściwości przeciwwirusowe i przypuszcza się, że hamują SARS-CoV-2. Ze względu na zapotrzebowanie na skuteczny środek przeciwko SARS-CoV-2, oceniliśmy działanie przeciwwirusowe AgNPs. Oceniliśmy mnóstwo AgNP o różnych rozmiarach i stężeniach i zaobserwowaliśmy, że cząstki o średnicy około 10 nm skutecznie hamowały zewnątrzkomórkowy SARS-CoV-2 przy stężeniach w zakresie od 1 do 10 ppm, podczas gdy efekt cytotoksyczny obserwowano przy stężeniach 20 ppm i wyższych. . Test wejścia pseudowirusa oparty na lucyferazie ujawnił, że AgNPs silnie hamowały etap przenikania wirusa poprzez zakłócanie integralności wirusa.Wyniki te wskazują, że AgNP są bardzo silnymi środkami bakteriobójczymi przeciwko SARS-CoV-2, ale należy je stosować ostrożnie ze względu na ich działanie cytotoksyczne i potencjalne zagrożenie dla ekosystemów środowiskowych w przypadku niewłaściwego utylizacji.
1. Wstęp
Pierwiastkowy metal, srebro (Ag), ma szerokie spektrum działania przeciwbakteryjnego przeciwko różnym bakteriom, grzybom i wirusom. Ze względu na swoją wszechstronność nanocząsteczki Ag (AgNP) znalazły obecnie zastosowanie jako środek bakteriobójczy na powierzchnie biologiczne w różnych formach, takich jak opatrunki na rany, wyroby medyczne, dezodoranty w sprayu i tkaniny. W kilku badaniach wykazano silne działanie przeciwwirusowe AgNP przeciwko różnym ludzkim wirusom patogennym, takim jak syncytialny wirus oddechowy (RSV), wirus grypy, norowirus, wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) i ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) [ 1 ]. Oprócz tych wirusów, ponieważ wykazano, że Ag zabija SARS-CoV, postawiliśmy hipotezę o silnej możliwości hamowania SARS-CoV-2 przez AgNP [ 2 , 3]. Do chwili obecnej nie ma badań bezpośrednio wykazujących wpływ AgNP na SARS-CoV-2. Przetestowaliśmy srebro koloidalne (cAg), zwykłe pierwiastkowe nanocząsteczki Ag o różnych średnicach (AgNP n ) i poliwinylopirolidon z zamkniętymi 10 nm nanocząstkami srebra (PVP – AgNP 10 ) względem SARS-CoV-2, aby znaleźć najbardziej efektywny rozmiar i stężenie Ag, które mogłoby hamować SARS-CoV-2. Proponujemy, aby AgNP można było stosować na nieożywionych i niebiologicznych powierzchniach, aby skutecznie kontrolować trwającą pandemię COVID-19, jednocześnie zachowując ostrożność, aby jej nie nadużywać.
2. Materiały i metody
2.1. Hodowla komórkowa i namnażanie wirusa
VeroE6 / TMPRSS2 (komórki VeroE6 stabilnie wyrażające transbłonową proteazę serynową TMPRSS2, JCRB # 1819) i linie komórkowe Calu-3 hodowano w DMEM zawierającym 10% FBS [ 4 ]. SARS-CoV-2 (JPN / TY / WK-521) uzyskano z NIID, JAPONIA, przechowywano w porcjach w -80 ° C i traktowano na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL3). Podczas wykonywania badań zakażenia SARS-CoV-2 stosowano DMEM zawierający 2% FBS.
2.2. Test łysinek
Test łysinkowy przeprowadzono na liniach komórkowych VeroE6 / TMPRSS2 i Calu-3 SARS-CoV-2, jak opisano w innym miejscu, z niewielkimi modyfikacjami [ 5 ]. 96-studzienkowe płytki zaszczepiono 5 x 10 4 komórek na dołek w 10% FBS / DMEM i pozostawia do wzrastania przez noc. Roztwór wirusa rozcieńczono w 10-krotnych seryjnych rozcieńczeniach w 2% FBS / DMEM. Supernatanty ze studzienek usunięto i zastąpiono rozcieńczeniami wirusa w odpowiednio oznakowanych studzienkach i inkubowano w 37 ° C przez 96 h, po czym komórki utrwalono 4% formaliną i wybarwiono 0,25% fioletem krystalicznym w celu uwidocznienia łysinek na białym tle. Medianę dawki infekującej dla hodowli tkankowej (TCID50) i krotność infekcji (MOI) obliczono z czterokrotnych testów.
2.3. Preparaty srebra
PVP-AgNP 10 o stężeniu wyjściowym 20 ppm (nr kat .: 795925) i cAg (nr kat .: 85131) uzyskano z Sigma. AgNP o różnych rozmiarach; AgNP 2 (nr kat .: US7150), AgNP 15 (nr kat .: US7091), AgNP 50 , AgNP 80 i AgNP 100 (US1038W) zakupiono od US Research Nanomaterials, Inc. Wszystkie preparaty srebra zdyspergowano w wodzie i stężenie przygotowano przez rozcieńczenie w sterylnej wodzie destylowanej.
2.4. Test żywotności komórek
Test CellTiter-Glo Cell Viability Assay (Promega) jest testem luminescencyjnym, który ilościowo wykrywa żywe komórki na podstawie poziomów adenozynotrifosforanu (ATP). Śmierć komórek w następstwie cytotoksyczności, w której pośredniczy Ag lub infekcji wirusowej, można szybko określić ilościowo za pomocą Cell-Titer Glo [ 6 ]. Do komórek dodano 50 µl CellTiter-Glo Substrate (Promega) i zmierzono ich żywotność w oparciu o intensywności luminescencji wykryte przez GloMax Discover System (Promega) 10 minut później.
2.5. RT-qPCR
Wirusowe RNA ekstrahowano z supernatantów hodowli przy użyciu zestawu QIAamp viral RNA Mini Kit (Qiagen) i przechowywano w temperaturze -80 ° C do dalszej analizy. Wyekstrahowany wirusowy RNA oznaczono ilościowo za pomocą CFX96 Real-Time System (Bio-rad) z TaqMan Fast virus 1-Step Master Mix (Thermo) przy użyciu 5′-AAATTTTGGGACCAGGAAC-3 ′ i 5′-TGGCAGCTGTGTAGGTCAA-3 ′ jako zestawu starterów i 5′-FAM-ATGTCGCGCATTGGCATGGA-BHQ-3 ′ jako sonda [ 7 ].
2.6. Badania cytotoksyczności
cAg lub AgNP w żądanym stężeniu dodawano do linii komórkowych VeroE6 / TMPRSS2 lub Calu-3 hodowanych na 96-dołkowych białych płytkach i inkubowano w 37 ° C odpowiednio przez 48 lub 96 h, po czym komórki przemywano PBS i określano żywotność oznaczono ilościowo za pomocą testu CellTiter-Glo.
3. Badania interakcji srebra i SARS-CoV-2
3.1. Test przed leczeniem wirusem
Wirus przy MOI 0,05 (dla VeroE6 / TMPRSS2) lub 0,5 (dla Calu-3) w DMEM zawierającym 2% FBS inkubowano z 2 ppm roztworu AgNP przez 1 godzinę w 37 ° C. Odpowiednią mieszaninę wirus-AgNP dodano do komórek VeroE6 / TMPRSS2 lub Calu-3 w 96-studzienkowych płytkach i inkubowano odpowiednio przez 48 godzin lub 96 godzin w 37 ° C. Żywotność komórek oceniano ilościowo w teście CellTiter-Glo, a kopie wirusa w supernatancie określano ilościowo za pomocą RT-qPCR.
3.2. Test po traktowaniu komórek
Komórki VeroE6 / TMPRSS2 zakażono SARS-CoV-2 (MOI = 0,05) i inkubowano przez 2 godziny w 37 ° C. Studzienki przepłukano PBS w celu usunięcia wirusów zewnątrzkomórkowych i uzupełniono DMEM zawierającym 2% FBS z 2 ppm PVP-AgNP 10 i inkubowano przez 48 godzin w 37 ° C. Żywotność komórek oceniano ilościowo w teście CellTiter-Glo, a kopie wirusa w supernatancie określano ilościowo za pomocą RT-qPCR.
3.3. Test wstępnej obróbki komórek
Komórki VeroE6 / TMPRSS2 traktowano 2 ppm PVP-AgNP 10 i inkubowano przez 3 godziny w 37 ° C. Następnie studzienki przemyto PBS w celu usunięcia wolnego AgNP w pożywce i uzupełniono DMEM zawierającym 2% FBS z SARS-CoV-2 (MOI = 0,05) i inkubowano przez 48 godzin w 37 ° C. Żywotność komórek oceniano ilościowo w teście CellTiter-Glo, a kopie wirusa w supernatancie określano ilościowo za pomocą RT-qPCR.
3.4. Immunofluorescencja
Komórki utrwalano 4% paraformaldehydem i permeabilizowano 0,5% Triton X-100, a następnie blokowano Blocking One (Nacalai) w temperaturze pokojowej przez 15 min. Komórki inkubowano z przeciwciałem poliklonalnym przeciwko białku nukleokapsydu SARS-CoV-2 (rozcieńczenie 1: 100, Novus NB100-56576) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po inkubacji komórki barwiono przeciwciałem przeciwkróliczym znakowanym Alexa 568 (rozcieńczenie 1: 1000, Thermo) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Jądro wybarwiono ProLong Gold Antifade Mountant z DAPI (Thermo). Obrazy wykonano mikroskopem fluorescencyjnym BZ-9000 (Keyence).
3.5. Test wejścia pseudowirusa
Lentiwirus pseudotypowy został wytworzony przez przejściową transfekcję komórek HEK293 pNL4-3. Luc.RE− i pSARS2-Spike-FLAG w stosunku 1: 1. Supernatanty hodowli zawierające pseudowirusy zebrano 48 godzin po transfekcji i przesączono przez filtr 0,45 µm Millex-HV (Merck). W teście wejściowym komórki VeroE6 / TMPRSS2 wysiane na 96-dołkowych płytkach przemyto i zaszczepiono 100 µl pożywki zawierającej pseudowirusa z lub bez PVP-AgNP 10 . Jako kontrolę hamowania wejścia zastosowano przeciwciało neutralizujące. 48 godzin po zaszczepieniu komórki przemyto i dodano 40 µl Bright-Glo Substrate (Promega). Aktywność lucyferazy mierzy się za pomocą GloMax Discover System (Promega).
4. Wyniki
4.1. Cytotoksyczność, skuteczna dawka i czas kontaktu
AgNP wykazują cytotoksyczność w stosunku do komórek ssaków poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu (RFT) [ 8 ]. Chcieliśmy ocenić zależną od stężenia cytotoksyczność wykazywaną przez Ag na liniach komórkowych VeroE6 / TMPRSS2 (pochodzenia innego niż ludzkie) i Calu-3 (komórki nabłonka płuc człowieka). cAg seryjnie rozcieńczano i dodawano do komórek w 96-studzienkowych płytkach, a żywotność komórek oceniano po 48 godzinach za pomocą testu CellTiter-Glo. Stwierdzono, że Ag wykazuje cytotoksyczność w stężeniach od 20 części na milion (ppm) wzwyż zarówno w liniach komórkowych VeroE6 / TMPRSS2 ( ryc. 1 A), jak i Calu-3 ( ryc. 1 B).
Cytotoksyczność srebra koloidalnego na komórkach ssaków 1A : Cytotoksyczność wykazywana przez kolejne stężenia srebra koloidalnego na komórkach VeroE6 / TMPRSS2. 1B : Cytotoksyczność wykazywana przez seryjne stężenia srebra koloidalnego na komórkach Calu-3.
Ponieważ cAg zawiera cząstki o wielkości od 1 do 1000 nm, użyliśmy go jako wstępnego badania przesiewowego w celu ustalenia wpływu AgNP na SARS-CoV-2. Wielokrotność infekcji (MOI) SARS-CoV-2 została obliczona w niezależnych eksperymentach i wynosiła 0,05 i 0,5 odpowiednio dla VeroE6 / TMPRSS2 i Calu-3. Zawiesinę wirusów o stałym MOI traktowano każdym seryjnym rozcieńczeniem cAg przez 1 godzinę, a następnie zaszczepiono do komórek VeroE6 / TMPRSS2 i Calu-3.Żywotność komórek zakażonych VeroE6 / TMPRSS2 oceniano po 48 godzinach w celu określenia odsetka komórek zabitych przez wirusa, a obciążenie wirusem oznaczano ilościowo w komórkach Calu-3 przy użyciu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) po 96 godzinach cAg wykazał silne działanie przeciwwirusowe, na co wskazuje zwiększona żywotność zakażonych komórek VeroE6 / TMPRSS2 w stężeniach w zakresie od 1 do 10 ppm (Rys. 2 A). W komórkach Calu-3 zaobserwowano znaczne zmniejszenie miana wirusa przy podobnym zakresie stężeń cAg ( ryc. 2 B). Chociaż jony metali są znanymi inhibitorami PCR w wysokich stężeniach, potwierdziliśmy, że przy efektywnym stężeniu (2 ppm) Ag nie hamuje amplifikacji i nadaje się do analizy wirusowego RNA w próbkach zawierających Ag ( ryc. S1 ) [ 9 ]. Ponieważ 2 ppm było również 10-krotnie niższe niż stężenie cytotoksyczne, wybrano je jako pożądane stężenie do dalszych testów.
Stężenie i zależne od dawki działanie przeciwwirusowe nagich nanocząstek srebra na SARS-CoV-2. 2A: Srebro koloidalne ratuje komórki VeroE6 / TMPRSS2 przed śmiercią komórkową, w której pośredniczy SARS-CoV-2 w sposób zależny od stężenia. Słupki błędów otrzymane z potrójnych testów. Wartość p ≤ 0,005 (∗∗∗). 2B: Zależne od stężenia hamowanie replikacji SARS-CoV-2 w komórkach Calu-3 przez srebro koloidalne. Słupki błędów otrzymane z potrójnych testów. Wartość p ≤ 0,001 (∗∗∗). 2C : Nanocząsteczki srebra wykazują zależne od wielkości działanie przeciwwirusowe przeciwko SARS-CoV-2 w komórkach Vero / TMPRSS2. Słupki błędów otrzymane z potrójnych testów. Wartość p ≤ 0,005 (∗∗∗). 2D: Zależne od wielkości wirusowe hamowanie SARS-CoV-2 przez nanocząsteczki srebra w komórkach Calu-3. Słupki błędów otrzymane z potrójnych testów. Wartość p ≤ 0,001 (∗∗∗).
Wcześniejsze badania udokumentowały zależną od wielkości siłę działania AgNP w inaktywacji wirusów, przy czym wielkość cząstek ≤10 nm ma maksymalny efekt przeciwwirusowy [ 10]. Ponieważ cAg zawiera cząstki Ag o różnej wielkości, przewidzieliśmy, że cząsteczki o wielkości około 10 nm w cAg wywarłyby efekt przeciwwirusowy. Aby to udowodnić, zastosowaliśmy test wstępnej obróbki wirusa (VPrA), aby przetestować działanie przeciwwirusowe AgNP o różnych rozmiarach w zakresie od 2 do 100 nm na wirusy zewnątrzkomórkowe. Wirus traktowano 2 ppm roztworem AgNP o różnej wielkości przez 1 godzinę i mieszaninę wirus-AgNP dodano do komórek VeroE6 / TMPRSS2 i Calu-3. Żywotność komórek oceniano ilościowo w teście CellTiter-Glo w VeroE6 / TMPRSS2, a kopie wirusa w supernatancie oznaczano ilościowo za pomocą RT-qPCR w komórkach Calu-3. Działanie przeciwwirusowe odnotowano w przypadku AgNP o wielkości od 2 do 15 nm ( ryc. 2 C i D). AgNP 2 wykazał cytotoksyczność przy 2 ppm, podczas gdy inne rozmiary nie ( ryc. S2). Dlatego do dalszych testów wybraliśmy PVP-AgNP 10 . Ponieważ zaobserwowaliśmy doskonałą aktywność przeciwwirusową VPrA po 1 godzinie, chcieliśmy poznać minimalny czas kontaktu wymagany przez Ag do zahamowania wirusa. Badanie przebiegu czasowego przeprowadzone na podstawie VPrA z PVP-AgNP 10 ujawniło znaczące hamowanie po 30 minutach kontaktu ( ryc. S3 ).
4.2. Srebro hamuje wirusy zewnątrzkomórkowe, zapobiegając przedostawaniu się wirusów
Następnie wykonaliśmy VPrA, test po obróbce komórek (CPoA) i test przed traktowaniem komórek (CPrA) na SARS-CoV-2 przy użyciu PVP-AgNP 10 w VeroE6 / TMPRSS2, aby obserwować wpływ Ag na wirusy zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe ( Rys. 3 A). VPrA wykazało skuteczne hamowanie pozakomórkowych wolnych wirionów charakteryzujące się zarówno redukcją śmierci komórek, jak i gwałtownym spadkiem wiremii do nieistotnych poziomów ( ryc. 3 B i C). Następnie przeprowadziliśmy CPoA, aby wykryć zdolność Ag do tłumienia wirusa w już zakażonych komórkach. W tym projekcie eksperymentalnym komórki VeroE6 / TMPRSS2 mogły być zakażone SARS-CoV-2 (MOI 0,05) przez 2 godziny, po czym wirusy zewnątrzkomórkowe przemyto, a następnie zakażone komórki potraktowano 2 ppm PVP-AgNP10 . Zaobserwowaliśmy znaczną ochronę zakażonych komórek i supresję obciążenia wirusem za pomocą PVP-AgNP 10 ( ryc. 3 B i C). Dodatkowo przeprowadziliśmy CPrA, aby ocenić zdolność komórek wstępnie potraktowanych srebrem do odporności na infekcję wirusową. Komórki VeroE6 / TMPRSS2 inkubowano z 2 ppm PVP-AgNP 10 przez 3 godziny, po czym komórki przemywano w celu usunięcia niezwiązanego srebra, a następnie infekowano SARS-CoV-2 (MOI 0,05). Pod koniec 48 h stwierdzono, że wirus był tylko częściowo zahamowany ( ryc. 3 C).
Nanocząsteczki srebra skutecznie hamują zewnątrzkomórkowy SARS-CoV-2. 3A : Schematyczne przedstawienie testu przed traktowaniem wirusem (panel górny), testu po traktowaniu komórek (panel centralny) i testu przed traktowaniem komórek (panel dolny). 3B : Wydajność 10 nm nanocząstek srebra powlekanych PVP w trzech projektach badań pod kątem ratowania komórek przed zakażeniem SARS-CoV-2. Słupki błędów otrzymane z potrójnych testów. Wartość p ≤ 0,005 (∗∗∗). 2C : Wydajność 10 nm nanocząstek srebra powlekanych PVP w trzech projektach badań w odniesieniu do redukcji replikacji SARS-CoV-2. Słupki błędów otrzymane z potrójnych testów. Wartość p ≤ 0,001 (∗∗∗).
Potwierdziliśmy zależne od wielkości działanie przeciwwirusowe PVP-AgNP 10 przy użyciu analizy immunofluorescencyjnej przeprowadzonej na modelu doświadczalnym VPrA; Zakażeniu SARS-CoV-2 skutecznie zapobiegł AgNP 10, a nie AgNP 100 ( ryc. 4 A). Test łysinkowy wykazał, że srebro osiągnęło całkowite zahamowanie 0,05 MOI, czyli jeden log 10 razy więcej niż kontrola wirusa. Zaobserwowano częściowe hamowanie z wyższą wiremią zaczynającą się od 0,5 MOI ( ryc. 4 B). Aby ocenić rolę AgNP we wnikaniu wirusa, przeprowadziliśmy test wejścia pseudowirusa oparty na lucyferze. PVP-AgNP 10silnie hamował wnikanie pseudowirusów, charakteryzując się znacznym zmniejszeniem aktywności lucyferazy podobnej do aktywności przeciwciała neutralizującego stosowanego jako kontrola ( ryc. 4 C).
Charakterystyka nanocząstek srebra 10 nm powlekanych PVP w zakażeniu SARS-CoV-2. 4A : Obrazowanie immunofluorescencyjne porównujące wpływ nanocząstek srebra 10 nm i 100 nm na zakażenie SARS-CoV-2 w komórkach VeroE6 / TMPRSS2. Jądra komórkowe (niebieskie) i białko nukleokapsydu SARS-CoV-2 w cytoplazmie (kolor czerwony). NC - kontrola negatywna. 4B : 10 nm nanocząsteczki srebra pokryte PVP chronią komórki VeroE6 / TMPRSS2 przed śmiercią komórkową wywołaną infekcją SARS-CoV-2. Zabarwienie fioletem krystalicznym ujawnia częściową ochronę z widocznymi blaszkami (czerwone groty strzałek) i całkowitą ochronę przy braku płytek (czarne groty strzałek). 4C: Test wejścia pseudowirusa. Pokryte PVP nanocząsteczki srebra 10 nm hamują wnikanie pseudowirusów do komórek VeroE6 / TMPRSS2. NC - kontrola negatywna, nAb - przeciwciało neutralizujące. (W celu interpretacji odniesień do koloru w legendzie tej figury czytelnika odsyła się do internetowej wersji tego artykułu).
5. Dyskusja
Ag jest od dawna znany ze swojego działania przeciwbakteryjnego, a właściwości przeciwwirusowe AgNP są szeroko badane z ponownym zainteresowaniem w niedawnej przeszłości [ 1 ]. Dokładny mechanizm, za pomocą którego AgNP zabija wirusy, jest nadal niejasny. Jednak konsekwentnie obserwowano, że AgNPs oddziałują z białkami strukturalnymi na powierzchni wirusów zewnątrzkomórkowych w celu zahamowania infekcji we wczesnej fazie, albo przez zapobieganie przyłączaniu się lub wnikaniu wirusów, albo przez uszkadzanie białek powierzchniowych, co wpływa na integralność strukturalną wirionów [ 11 , 12]. W obecnym badaniu uzyskaliśmy podobne wyniki w VPrA, gdzie AgNP skutecznie hamuje zewnątrzkomórkowy SARS-CoV-2, aby chronić komórki docelowe przed infekcją, a test wejścia pseudowirusa ujawnił, że AgNP zakłócają wnikanie wirusa.
Wykazano, że agNP preferencyjnie wiążą się z białkami powierzchniowymi wirusa bogatymi w grupy sulfhydrylowe i rozszczepiają wiązania disiarczkowe w celu destabilizacji białka, wpływając w ten sposób na infekcyjność wirusa [ 11 , 13 ]. Badania nad HIV wykazały, że AgNPs łączą się z wiązaniami disiarczkowymi, które znajdują się w bliskim sąsiedztwie domeny wiążącej CD4 białka powierzchniowego gp120 [ 11 ]. Hati i Bhattacharyya wykazali znaczenie wiązań dwusiarczkowych w wiązaniu białka wypustowego SARS-CoV-2 z receptorem enzymu konwertującego angiotensynę-2 (ACE2), których rozerwanie prowadzi do upośledzenia wiązania wirusa z receptorem [ 14]. Biorąc pod uwagę mechanizm działania AgNPs wykazany przez innych autorów, można przypuszczać, że AgNP wywierają działanie przeciwwirusowe na SARS-CoV-2 poprzez rozerwanie wiązań dwusiarczkowych na białku wypustowym i receptorze ACE2. Prowadzone są dalsze badania w celu znalezienia mechanizmu przeciwwirusowego AgNP na SARS-CoV-2 i późniejszego jego szczegółowego wyjaśnienia.
Stwierdzono również, że agNP mają wewnątrzkomórkowe działanie przeciwwirusowe poprzez interakcję z wirusowymi kwasami nukleinowymi [ 15 ]. Zaobserwowaliśmy częściowy efekt przeciwwirusowy w CPrA, ponieważ wystąpiło pewne zmniejszenie obciążenia wirusem w komórkach wstępnie potraktowanych PVP-AgNP 10 . Chociaż przyczyna tego efektu nie jest obecnie znana, prawdopodobnie wyjaśniono, że jest to spowodowane zniszczeniem mostków dwusiarczkowych na receptorze ACE2 lub prawdziwym mechanizmem wewnątrzkomórkowym (tam przez hamowanie seryjnej infekcji wirusowej nowo wytworzonego wirusa z zakażonych komórek do niezainfekowanych komórek). Ponadto, ponieważ Ag wiąże się niespecyficznie z białkami, ich stosowanie jako środków przeciwwirusowych może również powodować pewne dysfunkcje komórkowe. Konieczne są dalsze badania w celu dokładniejszego wyjaśnienia całościowego wpływu Ag in vivo.
W kilku badaniach potwierdzono zależne od wielkości działanie przeciwwirusowe AgNP, przy czym najbardziej skuteczne są cząsteczki o średnicy około 10 nm [ 1 ]. Przypisuje się temu wyższą stabilność interakcji z białkiem wirusa osiąganą przez cząsteczki o wielkości 10 nm, co nie jest możliwe w przypadku większych cząstek [ 11 ]. Zgodnie z tym, zaobserwowaliśmy również aktywność anty -SARS-CoV-2 tylko z AgNP o średnicach w zakresie od 2 do 15 nm. Nasze badanie immunofluorescencyjne potwierdziło powyższe zjawisko, ponieważ zaobserwowaliśmy, że PVP-AgNP 10 całkowicie hamował SARS-CoV-2, ale AgNP 100 nie.
AgNP można wytwarzać kilkoma metodami i mogą one zawierać środki redukujące i środki wiążące wraz z cząstkami metali [ 16 ]. Stwierdzono, że AgNP powlekane lub przykryte czapeczką są bardziej korzystne niż zwykłe AgNP, ponieważ powłoka zwiększa stabilność, zmniejsza aglomerację i zmniejsza cytotoksyczność AgNP [ 17 ]. Spośród powlekanych AgNP nanocząstki pokryte PVP są szeroko badane pod kątem zastosowań biologicznych. Zaobserwowano, że powlekanie PVP AgNPs nie ogranicza ich aktywności przeciwwirusowej, podczas gdy inne środki powlekające to robią [ 18 ]. Wykazano, że PVP-AgNP 10 ma doskonałą aktywność przeciwwirusową przeciwko wirusom otoczkowym, takim jak RSV i HIV [ 11 , 19 ]. To było uzasadnienie wyboru PVP-AgNP10 do badania i wykazaliśmy silny efekt przeciwwirusowy PVP-AgNP 10 na SARS-CoV-2.
Działanie przeciwwirusowe AgNP jest również zależne od stężenia. W większości badań obserwowano przeciwwirusową skuteczność AgNP w stężeniach od 10 do 100 ppm [ 1 ]. Jednak wykazano, że 0,5 ppm cAg jest skuteczne w hamowaniu wirusa grypy i jest to najmniejsze stężenie, o którym doniesiono, że wykazuje aktywność przeciwwirusową [ 20 ]. W obecnym badaniu zaobserwowaliśmy, że nagie AgNPs hamują SARS-CoV-2 w stężeniach w zakresie od 1 do 10 ppm i stają się cytotoksyczne dla komórek ssaków od 20 ppm i powyżej.
Cytotoksyczność AgNP w stosunku do komórek ssaków zależy od typu komórek, a także typu AgNP. Mehrbod i in. zaobserwowali cytotoksyczność w komórkach Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) z nagimi cząsteczkami cAg w stężeniach wyższych niż 0,5 ppm [ 20 ]. Stwierdzono, że nagie AgNP ze środkiem redukującym NaBH4 indukują apoptozę w komórkach gruczolakoraka okrężnicy przy 11 ppm, podczas gdy stabilizowane cytrynianem nagie AgNP wykazują cytotoksyczność w stężeniach powyżej 30 ppm [ 21 , 22 ]. W tym względzie wykazano, że AgNP pokryte PVP są najmniej cytotoksyczne bez widocznej cytotoksyczności nawet przy 50 ppm w ludzkich komórkach nabłonka podstawnych pęcherzyków płucnych [ 19]. Mniejsze cząsteczki mają wyższy potencjał toksyczny ze względu na większą powierzchnię oddziaływania z związanym białkiem [ 23 ]. Zaobserwowaliśmy ten efekt, ponieważ AgNP 2 wykazywał cytotoksyczność nawet przy 2 ppm, podczas gdy żadna z większych cząstek nie była cytotoksyczna w tym stężeniu. Dlatego należy zachować ostrożność podczas stosowania Ag na powierzchniach biologicznych.
Różne preparaty zawierające Ag do spożycia i inhalacji są sprzedawane jako lekarstwo na COVID-19, które można kupić bez recepty. Przed użyciem należy wziąć pod uwagę cytotoksyczny potencjał tych preparatów. Ponadto Ag jest środkiem bakteriobójczym o bardzo szerokim spektrum działania. Nielegalne stosowanie Ag może powodować zachwianie równowagi w komensalnej mikroflorze, prowadząc do nieprzewidzianych konsekwencji [ 24 ]. AgNP można stosować na różnych powierzchniach nieożywionych w celu zwalczania trwającej pandemii COVID-19 [ 3 ]. Stwierdzono, że maski pokryte powłoką Ag są skuteczne w hamowaniu SARS-CoV-2 i mogą być potencjalnie skuteczne, gdy są stosowane na filtrach powietrza w klimatyzatorach i urządzeniach medycznych [ 25 ]. Udowodniono, że tkaniny z polibawełny z dodatkiem AgNP hamują SARS-CoV-2 [ 26]. Do dezynfekcji rąk i powierzchni nieożywionych stosuje się również środki odkażające i dezynfekujące na bazie Ag [ 27 ]. Jednak wpływ AgNP na wpływ na życie mikroorganizmów po uwolnieniu do środowiska jest nieznany [ 16 ]. Należy opracować odpowiedni protokół utylizacji produktów zawierających Ag, aby uniknąć powodowania niepożądanego zaburzenia równowagi w środowisku mikrobiologicznym w przypadku wyrzucania po użyciu.
Deklaracja konfliktu interesów
Autorzy nie mają konfliktu interesów bezpośrednio związanego z treścią tego artykułu. YY jest obecnym pracownikiem Kanto Chemical Co., Inc.
Podziękowanie
Badanie zostało sfinansowane przez Japońską Agencję Badań i Rozwoju Medycznego (AMED), numer grantu: 19fk0108110h0401 i 20he0522001j0001.
Przypisy
Dodatek A Dodatkowe dane do tego artykułu można znaleźć w Internecie pod adresem https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2020.09.018 .
Dodatek A. Dodatkowe dane
Poniżej przedstawiono dane uzupełniające do tego artykułu:
Komponent multimedialny 1:
Brak komentarzy:
Prześlij komentarz